О ПЦР-диагностике

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) была открыта в 1983 г. и американский “Science” назвал это открытие самым выдающимся открытием последних лет.

С быстротой молнии метод распространился по всему миру. ПЦР используется для проведения научных и практических исследований. Но прежде всего метод нашел широкое применение в области микробиологической диагностики.

Что такое полимеразная цепная реакция

ПЦР - это метод, который позволяет найти в исследуемом клиническом материале небольшой участок генетической информации любого организма среди огромного количества других участков и многократно размножить его. Метод ПЦР основан на принципе естественной репликации ДНК. Включающем расплетение двойной спирали ДНК, расхождение нитей ДНК и комплиментарное дополнение обеих. Репликация ДНК может начаться не в любой точке, а только в определенных стартовых блоках - коротких двунитевых участках. Суть метода заключается в том, что маркировав такими блоками специфический только для данного вида (но не для других видов) участок ДНК, можно многократно воспроизвести (амплифицировать) именно этот участок.

Принцип метода

Для того чтобы осуществить такой процесс в пробирке, используют две генетические пробы, называемые праймерами, которые и служат в качестве затравки для синтеза выбранного участка ДНК. При внесении в исследуемую пробу праймеры подобно паре генетических детективов прочесывают раствор в поисках участка, которому они комплементарны и, следовательно, способны присоединится, образовав двунитчатый стартовый участок. После присоединения (отжига) праймеров начинается воспроизведение с помощью фермента - Taq-полимеразы специфического фрагмента ДНК вновь синтезированные фрагменты ДНК служат в качестве матрицы для синтеза новых нитей в следующем цикле амплификации - это и есть цепная реакция в ПЦР. В результате количество копий фрагмента увеличивается в геометрической прогрессии и через 25 циклов амплификации синтезируются 106 копий фрагмента. В течение 30-40 циклов нарабатывается количество ДНК, достаточное, чтобы визуально учитывать результаты реакции после электрофореза в агарозном геле.

Преимущества метода

Полимеразная цепная реакция в настоящее время является наиболее совершенным диагностическим методом, позволяющим выявлять единичные клетки возбудители многих инфекционных заболеваний за счет многократного увеличения количества копий тестируемых специфических последовательностей ДНК.

Тест-системы, основаны на принципе амплификации ДНК, позволяет обнаруживать патогенные для человека бактерии и вирусы даже в тех случаях, когда другими способами (иммунологическим, бактериологическим, микроскопическим) их выявление невозможно.

Это преимущество достигается за счет высокой чувствительности ПЦР- системы, которая составляет около 10 бактериальных клеток, в то время как чувствительность и монологических и микроскопических тестов колеблется в пределах 103-106 клеток.

Тест-системы на основе ПЦР эффективен при диагностике трудно культивируемых, не культивируемых и персистирующих форм патогенных бактерий.

С этим приходится сталкиваться при латентных и хронических инфекциях, а также при тестировании объектов внешней среды. ПЦР-диагностикумы позволяют избежать основной трудности, связанной с неспособностью таких бактерий размножаться в лабораторных условиях. При ПЦР - диагностике размножению подвергается не бактерия, а только ее ДНК, причем не вся молекула ДНК, а только определенный фрагмент, являющийся маркером данного возбудителя.

ПЦР-диагностикумы, в отличие от иммунологических тест-систем, позволяют избежать проблем, связанных с перекрестно-реагирующими антигенами, тем самым обеспечивая абсолютную специфичность.

Определение можно проводить непосредственно в клиническом материале (кровь, сыворотка, лаважные массы, мокрота, слюна, желудочный сок, биопсийный материал, мазки, смывы) ив материале, получаемом из объектов внешней среды (вода, почва).

Объем продаж ПЦР-диагностикумов по данным зарубежных источников в 1994 году составил 2 миллиарда долларов США.

Почему нужна амплификация гена или его фрагмента для доказательства наличия инфекционного возбудителя или идентификации генетической мутации? До ПЦР и других методов амплификации нуклеиновых кислот для целей использовали ДНК -зондовую детекцию, основанную на гибридизации меченных радио -активным изотопом или флуоресцентным веществом специфических олигонуклеотидных зондов с образцом выделенной ДНК. Однако ДНК-зондовая диагностика имеет существенные ограничения как по своей чувствительности, так и по трудоемкости и длительности: для ее осуществления необходимо выделить достаточно интактную ДНК из не менее чем 10000 клеток, а сам процесс гибридизации не может быть полностью автоматизирован. Предварительная быстрая амплификация in vitro позволяет детектировать единичные микробные или мутантные клетки и в большинстве случаев делает необязательным применение для детекции ДНК-гибридизацию. Амплифицированная ДНК без предварительного клонирования может быть подвергнута секвенированию для идентификации точечных мутаций.

Механизмы ПЦР

Изолированное умножение гена или его фрагмента называют амплификацией ,которая одним из способов выживания микроорганизмов и клеток животных, например, в условиях действия противоопухолевых и противобактериальных препаратов. ПЦР позволяет осуществлять такую амплификацию в пробирке при помощи фермента термостабильной ДНК-полимеразы из 4 дезоксинуклеозид-трифосфатов, являющихся структурными элементами всякой ДНК и коротких олигонуклеотидных 20-30-членных затравок (праймеров), комплиментарных 3-концевым последовательностям антипараллельных цепей ДНК гена. Повторяя 3 стадии, изображенные на рисунке 1, 30-35 раз за 2-3 часа получают миллионы копий специфического участка ДНК вируса, бактерий или клеток крови.

ПЦР состоит из 3 основных процедур: подготовки исследуемой пробы материала, которая в большинстве случаев сводится к изоляции ДНК или РНК, собственно ПЦР и детекции продукта ПЦР (амплифицированной ДНК). Пятью основными компонентами ПЦР являются следующие:

• фермент Taq-ДНК-полимераза;
• пара олигонуклеотидных праймеров;
• 4 типа дезоксинуклеозидтрифосфатов (дНТФ);
• копируемая ДНК;
• ионы Mg+2.

Вспомогательными компонентами являются буферный раствор и минеральное масло. Ниже приведены краткие описания компонентов.

Праймеры - это короткие, длиной 20-30 оснований, одноцепочечные ДНК (дезоксиолигонуклеотиды), комплиментарные 3-концам цепей копируемой ДНК-матрицы, благодаря которым ограничивается фрагмент ДНК, который будет миллионы раз скопирован ферментом Taq-ДНК-полимеразой, присоединяющейся к 3-концам праймеров и достраивающей их до заданной длины в несколько сот или тысяч пар оснований. Поскольку праймеры каждый раз встраивается в амплифицируемые фрагменты ДНК-матрицы (амплификоны), то они в реакционной смеси ПЦР присутствуют в избытке: концентрация их составляет 0,5 - 1,0 мкМ. Специфичность получаемого продукта ПЦР в значительной степени определяется так называемой температурой отжига праймеров, при которой они взаимодействуют с комплиментарными участками ДНК- матрицы, образуя даухцепочечные структуры. Температура отжига определяется длиной праймера и содержанием ГЦ-пар и рассчитывается по следующей формуле:

Т = [(A+T) x 2] + [(Г+С) х 4] - 5Ц (К.Itakura et al).

При отклонениях в температуре плавления внутри одной пары праймеров выбор температуры отжига будет менее строгим. Как правило, праймеры для ПЦР-детекции инфекционных возбудителей создают на консервативные участки их ДНК, которые редко подвергаются генетическим перестройкам. Писки таких участков осуществляют при помощи специальных компьютерных программ.

Предупреждение ложно-положительных результатов ПЦР

Чувствительность ПЦР может достигать математически возможного предела (детекции 1 копии ДНК- матрицы), поэтому существует высокая степень опасности получения ложно- положительными результата в силу переноса через предметы и реогенты как самой ДНК- матрицы (реже), так и аплифеконов (очень часто), получаемых в больших количествах во многих пробирках в течение ежедневной работы. В связи с этим нами разработаны специальные требования к планировке и режиму работы ПЦР-генодиагностической лаборатории. Причинами ложно- положительных результатов являются следующие 3 вида контаминации:

• Перекрестная контаминация от пробы к пробе (в процессе обработки клинических образцов или при раскапывании реакционной смеси), приводящей к появлению спорадических ложно-положительных результатов;
• Контаминация рекомбинантными плазмидами, содержащими клонированные последовательности детектируемого гена;
• Контаминация продуктами амплификации (амплификонами) являются наиболее частой причиной ложно- положительных результатов, поскольку в процессе ПЦР- диагностики амплификоны накапливаются в больших количествах и очень легко переносятся с аэрозолями и через приборы. Поэтому детекция продуктов ПЦР должна проводиться в изолированной комнате сотрудником, не производящим обработку клинических образцов и не готовящим реактивы для ПЦР. Приготовление основных растворов также должно производится в отдельной чистой комнате. Все растворы должны храниться и использоваться в небольших порциях.

Необходимо постоянно использовать собственные лабораторные контроли и периодически применять зашифрованные отрицательные и положительные контрольные образцы для оценки специфичности и чувствительности ПЦР- генодиагностических исследований.

Неуклонно выполняя эти требования и применяя в каждой ПЦР отрицательные контроли: на процедуру экстракции, буферный раствор, праймеры (пробирки, не содержащие ДНК- матрицы, но содержащие избыток клеточной ДНК), можно практически исключить ложноположительные результаты ПЦР (J.S. Bootman и P.A. Kitchin).

В настоящее время хорошо апробированы и применяются в ПЦР- генодиагностике методы ферментативного и химического предупреждения ложно-положительных результатов от контаминации амплификонами(S.Kwok, R.Higuchi; P.A.Kitchin et al). Суть ферментативного метода заключается в том, что вместо одного их 4-х дНТФ, а именно вместо дТТФ, вводится его аналог дезоксиуредин-трифосфат (дУТФ), который, включившись в амплификон вместо дТТФ, делает этот амплификон чувствительным к ферменту урацил-гликозилазе, которая также вводится в ПЦР - амплификационную смесь. И если в пробирку с ПЦР - аплификационной смесью были занесены амплификоны, содержащие дУНФ, то они будут расщеплены этим ферментом. Некоторые коммерческие ПЦР - тест-системы содержат эти компоненты, и поэтому гарантируют отсутствие ложно- положительных результатов от контаминации. В качестве химического способа для предупреждения ложноположительных результатов от контаминации амплификонами используют псорален- соединение, делающие амплификоны легко повреждаемыми ультрафиолетовыми лучами.

Перечень достоинств ПЦР-генодиагностики инфекций

Метод прямой и позволяет достичь предельно возможной чувствительности: от нескольких копий до одного возбудителя в пробе.

Специфичность метода равна 100%.

Для ПЦР-анализа пригоден любой материал, в том числе и гистологические препараты.

Количество исследуемого материала, как правило, составляет несколько десятков микро литров но при низкой концентрации возбудителя может быть увеличена в сотни и тысячи раз за счет экстракции ДНК и РНК.

Метод позволяет определять число копий возбудителя в пробе и тем самым контролировать виремию или бактеремию в процессе лечения.

Исследуемый материал может быть дезинфицирован химической или термической обработкой в момент его забора, и, следовательно исключается возможность инфицирования персонала в процессе проведения ПЦР.

Простота исполнения и возможность полной автоматизации.

Результаты получают через несколько часов, то есть в течение одного рабочего дня.